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王鹏,刘永兰,雷小英,等.In-Fusion克隆技术构建HBV X基因真核表达质粒[J].现代仪器与医疗,2014,20(2):1-5.
doi:
10.11876/mimt201402001
标题:
In-Fusion克隆技术构建HBV X基因真核表达质粒
作者:
王鹏,刘永兰,雷小英,郭瑞娟,向安,郭晏海
作者单位:
(1.第四军医大学药学院学员二队,西安 710032;2.第四军医大学药学院药物基因组学教研室/全军基因诊断技术研究所,西安 710032)
摘要:
目的:以血清中乙型肝炎病毒(HBV)DNA为模板,克隆构建HBV X蛋白质的真核表达载体pcDNA-HBx。方法:设计扩增HBV X基因的In-Fusion PCR引物,采用高保真DNA聚合酶分两段扩增HBV X基因序列;采用In-Fusion克隆技术,将两段X基因扩增片段一步克隆入经Hind III和Xba I双酶切的pcDNA3.0真核表达载体,以构建重组真核表达载体pcDNA-HBX;采用Hind III和Xba I双酶切和DNA序列测序筛选鉴定重组载体;pcDNA-HBx 转染HepG2细胞,Western blot检测pcDNA-HBx转染细胞的HBx蛋白质表达。结果:In-Fusion PCR引物分两段扩增获得全长HBx基因序列;In-Fusion获得克隆的pcDNA-HBx经双酶切筛选得到阳性重组质粒,测序分析证实插入序列正确;转染pcDNA-HBX的HepG2细胞,Western blot证实表达HBx蛋白质。结论:以血清HBV DNA为模板克隆HBV X基因,构建了表达HBV HBx蛋白质的真核表达载体,为HBx蛋白质的生物学功能研究提供支持。
关键词:    乙型肝炎病毒;HBV X基因;基因克隆;表达载体;真核表达
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